シングルセルレパトア解析

シングルセルレパトア解析では個々のT細胞 / B細胞のmRNAにそれぞれ異なるバーコードを付けることで、1細胞単位のTCR / BCR 発現を調べることができます。

標準的なレパトア解析では全細胞のTCR / BCR発現を包括的に解析しますが、シングルセルレパトア解析では、細胞ごとに高感度にレパトア発現を検出することができ、TCR / BCR 二量体配列の組み合わせも検出可能です。

なお、シングルセルレパトア解析に加え、シングルセル 5’RNA-Seqも実施可能です。

シングルセルレパトア解析

シングルセルレパトア解析では個々のT細胞 / B細胞のmRNAにそれぞれ異なるバーコードを付けることで、1細胞単位のTCR / BCR 発現を調べることができます。

標準的なレパトア解析では全細胞のTCR / BCR発現を包括的に解析しますが、シングルセルレパトア解析では、細胞ごとに高感度にレパトア発現を検出することができ、TCR / BCR 二量体配列の組み合わせも検出可能です。

なお、シングルセルレパトア解析に加え、シングルセル 5’RNA-Seqも実施可能です。

シングルセルレパトア解析の特徴

  • 希少なTCR / BCR (Ig) 発現を検出
  • 細胞ごとのTCR / BCR (Ig) が同定可能
  • BCR(Ig)のH鎖 / L鎖または、TCRのα鎖 / β鎖 配列のペア解析が可能
  • TCR / BCR解析と併せてシングルセル 5’RNA-seqも実施可能

サービス概要

当社は日本で唯一の10x Genomics社認証プロバイダーであり、高品質かつスピーディーなシングルセルライブラリー作製サービスを、リーズナブルな価格でご提供いたします。

お客様から細胞をご送付いただき、シングルセルレパトアライブラリーを作製します。ご要望に応じて、シーケンスやバイオインフォマティクス情報解析も行います。

詳細はサービスの流れをご確認ください。

サンプル調整のフロー

10x Genomics社のChromium Single Cell V(D)J Reagent Kitsを使用し、以下のフローでサンプルを調整します。

細胞凍結
細胞分散した後、40μmのフィルターを通しセルバンカー等の凍結溶液で凍結保存してください。凍結融解後に以下の条件を満たすことを事前にご確認ください。

細胞数100万細胞以上

生存率80%以上

細胞サイズは直径30μm以下

細胞溶解・セルカウント
細胞受領後、セルカウンターによる細胞数・生存率測定
シングルセル単離
オイルと水のドロップレットにより細胞を1つ1つに単離
細胞1つにつき1種類のバーコード配列がドロップレットに含まれる
ライブラリー作製
cDNA合成・PCR増幅
シーケンス
5,000細胞以上解析・リード数5000/細胞以上(レパトア)、リード数2万/細胞以上(5’RNA-Seq。5’RNA-Seqも同時に行う場合)を基準にしてシーケンス
画像追加
データ解析

Cell RangerでFastq解析

  • Estimated Number of Cells
  • Mean Reads per Cell
  • Number of Cells With Productive V-J Spanning Pair
  • Cells With Productive V-J Spanning Pair (%)
  • Paired Clonotype Diversity
  • Cells With CDR3-annotated Contig (%)
  • Cells With V-J Spanning Contig (%)
バイオインフォマティクス解析

LoupeBrowser (10x Genomics社製ソフト)や独自パイプライン等を用いた解析
例)

クラスタリング結果(UMAP)

クラスタリング結果(UMAP)

各クラスタの発現遺伝子(Heatmap)+ Cluster-specific genes

各クラスタの発現遺伝子(Heatmap)+ Cluster-specific genes

各遺伝子発現解析(UMAP)

各遺伝子発現解析(UMAP)

VDJ情報を追加し解析した遺伝子ごとの細胞割合

VDJ情報を追加し解析した遺伝子ごとの細胞割合

サンプル受け入れ条件

凍結細胞からの調整の場合、以下の条件を満たすサンプルのみ受け入れ可能です。

・ヒトまたはマウス細胞である
・細胞が単離された状態で凍結されている
・細胞数100万細胞以上
・(凍結融解後)生存率80%以上
・細胞サイズは直径30μm以下
・(ヒト生体試料・臨床検体の場合) 情報が匿名化されている

出張で新鮮細胞から対応できます

細胞数が少ない or 凍結するとバイアビリティが低くなる 場合、Chromium Single Cell Controllerを研究室に持ち込み、新鮮細胞からシングルセル化を行います。(別途オプション価格がかかります。)

TotalseqC-Hashtag抗体で複数サンプルを1検体分として調整可能です

特定のマーカーが発現されている細胞であれば、TotalSeqB-Hashtag抗体で細胞ごとにタグ付けし、複数サンプルをまとめて1検体として調整できます。 (別途オプション価格がかかります。)

・1検体当たりの解析対象が最大1万細胞のため、複数サンプル混合の場合、1サンプル当たりの解析細胞数はその分減少します。
・以下のマーカーが発現されている細胞に限ります。
ヒト:CD298 または β2ミクログロブリン
マウス:CD45 または H-2 MHCクラスI
・BioLegendのライセンスの都合上 、Totalseq抗体はお客様でご購入する必要があります。

参考:マルチオミクス解析用試薬 TotalSeq™

ライブラリ作製の途中からご委託可能です

step1.5 GEM-RT Incubationまでお客様で実施いただき、サンプルと試薬を送付いただければ、step2.1 Post GEM RT-Cleanup – Dynabeadからご委託可能です。

10x Genomics社について

10xGenomics社は生物医学をさらに前進させ、疾患の理解と治療を変革させるビジョンと共に創立された、アメリカのライフサイエンステクノロジー企業です。10xGenomics社では生物学システムを解明するソリューションを、複雑な生物学に合致する解像度と規模で構築しています。装置、試薬キット、ソフトウェアから構成される製品を拡大し、がん、免疫、神経科学、発生学の研究分野において革新的な発見を可能にします。

10x Genomics社の提供するシングルセルソリューションはこれまでに世界中の多くの研究者に受け入れられ、デファクトスタンダードなプラットフォームとなっています。

料金・納期

細胞種や解析内容によっては、上下することもございます。

受託内容 金額(消費税抜) おおよその納期
ライブラリーの作製 シングルセル 5’
TCRseq or BCRseq

¥690,000

3週間
シングルセル 5’
TCRseq
+ BCRseq
¥840,000 3週間
シングルセル5’
RNA-seq
+ TCRseq or BCRseq
¥830,000 3週間
シングルセル5’
RNA-seq
+ TCRseq
+ BCRseq
¥900,000 3週間
ライブラリーの作製
+シーケンス
+Cell Ranger解析
¥880,000〜 6週間
ライブラリーの作製
+シーケンス
+より高度なバイオインフォマティクス情報解析
お問い合わせください 3ヶ月~

よくあるご質問

シングルセルでレパトア解析をする意味は何でしょうか。

シングルセルシーケンスにより、TCRのα鎖 / β鎖あるいはBCRのH鎖 / L鎖のペアを検出することができます。シングルセルレパトア解析では、細胞ごとに異なるバーコード配列をmRNAに付加して解析を行います。TCR又はBCRに関連するmRNAも細胞ごとに分けられるため、各細胞がどのペアのTCR / BCR配列を持っているかがわかります。

どのくらいの細胞数・遺伝子数を検出することができますか。

最新の10x Genomics社のアプリケーションでは、最大で10,000 細胞、2,000 遺伝子を検出することが可能です。TCR又はBCRのペア鎖の検出率は通常80%以上です。ただし細胞の種類や状態、シーケンス条件により変動します。

TCR / BCRは全領域を検出できますか。

可変部の全領域を検出することができます。BCRはisotype情報も検出可能です。10x Genomics社のアプリケーションでは、Short readからLong readを生成するアルゴリズムが備わっており、シーケンスのリードよりも長い配列を生成することが可能です。

どのような検体を提出すればよいですか。

凍結した細胞を、ドライアイスを入れた状態でお送りください。1サンプル当たり、100万細胞、生存率80%以上が条件です。この条件以外のサンプルを希望される場合は、お問い合わせからご相談ください。

納品物は何でしょうか。

お客様がシーケンスをされる場合、ライブラリーを作製しお送りします。当社でシーケンスをする場合、シーケンス結果のFastqファイルとCell Ranger(解析ソフトウェア)での解析結果のデータをお送りします。

FACSやCITE-seqなどのオプション実験を追加することはできますか。

可能です。当社ではFACSをはじめ、最新の機器を揃えています。ご希望の実験をお問い合わせからご相談ください。

自分でシーケンスする場合、シーケンスの条件はどのようにしたらいいでしょうか。

10x Genomics社のSingle Cell VDJ-seqアプリケーションでは、以下の条件でのシーケンスが推奨されています。

TCR/BCRのみ

リード数:5,000リード以上/細胞
Read 1:26 cycle
i7 Index:8 cycle
i5 Index:0 cycle
Read 2:91 cycle

TCR/BCR + 5’ RNA-seq

リード数(TCR/BCR):5,000リード以上/細胞
リード数(5’ RNA-seq): 20,000リード以上/細胞
Read 1:26 cycle
i7 Index:8 cycle
i5 Index:0 cycle
Read 2:91 cycle