シングルセルRNA-seq解析
シングルセル 3’RNA-seq解析では個々の細胞にそれぞれ異なるバーコードを付与することで、細胞ごとの遺伝子発現を調べることができます。標準的なRNA-Seqでは全細胞における平均的な遺伝子発現を検出するのに対し、シングルセル 3’RNA-seqでは、細胞ごとのmRNA遺伝子発現を高感度に検出することが可能です。
シングルセルRNA-seqの特徴
- 同一細胞内のmRNA発現を同定可能
- 希少な細胞種やmRNA発現を検出
- 細胞の不均一性を解析
サービス概要
当社は日本で唯一の10x Genomics社認証プロバイダーであり、高品質かつスピーディーなシングルセルライブラリー作製サービスを、リーズナブルな価格でご提供いたします。
お客様から細胞をご送付いただき、シングルセルRNA-seqのライブラリーを作製します。ご要望に応じて、シーケンスやバイオインフォマティクス情報解析も行います。
詳細はサービスの流れをご確認ください。
サンプル調整のフロー
10x Genomics社のChromium Next GEM Single Cell 3ʹ Reagent Kitsを使用し以下のフローでサンプルを調整します。
- 細胞凍結
- 細胞分散した後、40μmのフィルターを通しセルバンカー等の凍結溶液で凍結保存してください。凍結融解後に以下の条件を満たすことを事前にご確認ください。
細胞数100万細胞以上
生存率80%以上
細胞サイズは直径30μm以下
- 細胞溶解・セルカウント
- 細胞受領後、セルカウンターによる細胞数・生存率測定
- シングルセル単離
-
オイルと水のドロップレットにより細胞を1つ1つに単離
細胞1つにつき1種類のバーコード配列がドロップレットに含まれる
- ライブラリー作製
- cDNA合成・PCR増幅
- シーケンス
- 5,000細胞以上解析・リード数5000/細胞以上(レパトア)、リード数3万/細胞以上を基準にしてシーケンス
- データ解析
-
Cell RangerでFastq解析
- Estimated Number of Cells
- Mean Reads per Cell
- Median Genes per Cell
- Reads Mapped Confidently to Genome (%)
- Reads Mapped Confidently to Intergenic Regions
- Fraction Antibody Reads (%)
- Reads Mapped Confidently to Intronic Regions (%)
- Reads Mapped Confidently to Exonic Regions (%)
- Reads Mapped Confidently to Transcriptome (%)
- Reads Mapped Antisense to Gene (%)
- バイオインフォマティクス解析
-
LoupeBrowser (10x Genomics社製ソフト)や独自パイプライン等を用いた解析例）
クラスタリング結果（UMAP）
各クラスタの発現遺伝子（Heatmap）＋ Cluster-specific genes
各遺伝子発現解析（UMAP）
サンプル受け入れ条件
凍結細胞からの調整の場合、以下の条件を満たすサンプルのみ受け入れ可能です。
・細胞が単離された状態で凍結されている
・細胞数100万細胞以上
・（凍結融解後）生存率80%以上
・細胞サイズは直径30μm以下
・(ヒト生体試料・臨床検体の場合) 情報が匿名化されている
出張で新鮮細胞から対応できます
細胞数が少ない or 凍結するとバイアビリティが低くなる 場合、Chromium Single Cell Controllerを研究室に持ち込み、新鮮細胞からシングルセル化を行います。（別途オプション価格がかかります。）
TotalseqB-Hashtag抗体で複数サンプルを1検体分として調整可能です
特定のマーカーが発現されている細胞であれば、TotalSeqB-Hashtag抗体で細胞ごとにタグ付けし、複数サンプルをまとめて1検体として調整できます。 （別途オプション価格がかかります。）
・1検体当たりの解析対象が最大1万細胞のため、 複数サンプル混合の場合、1サンプル当たりの解析細胞数はその分減少します。
・以下のマーカーが発現されている細胞に限ります。
ヒト：CD298 または β2ミクログロブリン
マウス：CD45 または H-2 MHCクラスI
・BioLegendのライセンスの都合上 、Totalseq抗体はお客様でご購入する必要があります。
ライブラリ作製の途中からご委託可能です
step1.5 GEM-RT Incubationまでお客様で実施いただき、サンプルと試薬を送付いただければ、step2.1 Post GEM RT-Cleanup – Dynabeadからご委託可能です。
10x Genomics社について
10xGenomics社は生物医学をさらに前進させ、疾患の理解と治療を変革させるビジョンと共に創立された、アメリカのライフサイエンステクノロジー企業です。10xGenomics社では生物学システムを解明するソリューションを、複雑な生物学に合致する解像度と規模で構築しています。装置、試薬キット、ソフトウェアから構成される製品を拡大し、がん、免疫、神経科学、発生学の研究分野において革新的な発見を可能にします。
10x Genomics社の提供するシングルセルソリューションはこれまでに世界中の多くの研究者に受け入れられ、デファクトスタンダードなプラットフォームとなっています。
ご使用例
近年シングルセルRNA-seqを使用してシングルセル解析独自の視点から様々な論文が発表されています。以下はその一例です。
料金・納期
細胞種や解析内容によっては、上下することもございます。
| 受託内容 | 金額(消費税抜) | おおよその納期 |
|---|---|---|
| ライブラリーの作製 | ￥730,000 | 3週間 |
| ライブラリーの作製 + シーケンス + Cell Ranger解析有り |
￥920,000 |
6週間 |
| ライブラリーの作製 + シーケンス + より高度なバイオインフォマティクス情報解析 |
お問い合わせください | 3ヶ月～ |
よくあるご質問
シングルセルRNA-seqと、標準的なRNA-seqの違いは何ですか？
標準的なRNA-seqは、全細胞の平均的な遺伝子発現量を検出するのに対し、シングルセル RNA-seqは細胞１つ１つの遺伝子発現量を検出することができます。このことにより、細胞集団、細胞種、細胞状況及びさらに多くの情報を個々の細胞レベルで特性化できます。不均一な試料中における細胞間遺伝子発現変動性を明らかにし、希少な細胞種を特定することで、発生及び疾患における細胞寄与をより明らかに同定できます。
どのくらいの細胞数・遺伝子数を検出することができますか。
最新の10x Genomics社のアプリケーションでは、最大で10,000細胞、2,000遺伝子を検出することが可能です。ただし細胞の種類や状態、シーケンス条件により変動します。
シングルセルRNA-seqでは、どの領域を読むのでしょうか。
10x Genomics社のシングルセルRNA-seqアプリケーションでは、3’領域をシーケンスすることで、シーケンスコストを抑えています。また、レパトア解析に用いられるアプリケーションでは、5’領域をシーケンスします。
どのような検体を提出すればよいですか。
凍結した細胞を、ドライアイスを入れた状態でお送りください。1サンプル当たり、100万細胞、生存率80%以上を条件としています。この条件以外のサンプルを希望される場合は、お問い合わせからご相談ください。
納品物は何でしょうか。
お客様がシーケンスをされる場合、ライブラリーを作製しお送りします。当社がシーケンスをする場合、シーケンス結果のFastqファイルとCell Ranger（解析ソフトウェア）での解析結果のデータをお送りします。
サンプルやデータの保管はどのようにしますか？
納品後、3ヵ月を経過すると廃棄いたします。予めご了承ください。
FACSやCITE-seqなどのオプション実験を追加することはできますか。
可能です。当社ではFACSを始めとした、最新の機器を揃えております。ご希望の実験をお問い合わせからご相談ください。
自分でシーケンスする場合、シーケンスの条件はどのようにしたらいいでしょうか。
10x Genomics社のSingle cell RNA-seqアプリケーションでは、以下の条件でのシーケンスが推奨されています。
リード数：20,000リード以上/細胞
Read 1：28 cycles
i7 Index：8 cycles
i5 Index：0 cycle
Read 2：91 cycles
